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本制品在60min内即可分离出完整的线粒体，获得的线粒体具有完整的双层膜结构和很高的生物学活性，可用于细胞凋亡、信号转导和代谢研究等下游应用以及线粒体蛋白质组学研究。此外，提取的线粒体经裂解液裂解后即可得到线粒体蛋白，可用于线粒体蛋白分析、SDS-PAGE、WB、IP等实验。本制品可兼容动物组织及动物细胞中线粒体的提取。

• 纯度高：利用两步密度梯度离心的原理，提取到的线粒体纯度更高。
  
• 活性高：所提取的线粒体保留有完整的结构，并具有很高的生物学活性。

• 线粒体的功能或酶活性研究。
  
• 线粒体蛋白分析：如SDS-PAGE、免疫印迹（WB）、免疫沉淀(IP)、蛋白质组学研究等。
  
• 线粒体DNA（mtDNA）提取。

• 提取全程请低温无菌操作，样品管需放在冰浴中。
  
• 在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的关键，破碎效果与组织细胞类型有关，不同型号匀浆器的破碎效果也不同。
  
• 处理细胞样品时破碎步骤较为关键，解决方案有：
  
  • 选用间隙严密的研杵。将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。
    
  • 使用超声破碎仪破碎。可选用最低功率，探索破碎条件。
• 用线粒体保存液重悬线粒体后，请及时使用。如无法及时使用，建议-80℃保存。冻存后的线粒体样品不推荐用于完整线粒体功能的研究，但可以用于线粒体蛋白分析、WB、IP等实验。

• 将试剂盒各组分置于冰上，使用时需进行无菌操作，将离心机、玻璃匀浆器4℃预冷。
  
• 样品准备：
  
  • 组织样品：将新鲜组织样品用适量预冷的1×PBS清洗，取100mg组织加入到合适大小的匀浆器中，加入1mL线粒体提取液A。
    
    请勿使用经冷冻保存的组织样品。
    
    
  • 细胞样品：离心5min（500×g，4℃）收集细胞，用适量预冷的1×PBS重悬细胞，取2×10⁷个细胞，离心5min（500×g，4℃）后弃尽上清，加入1mL线粒体提取液A重悬细胞，并转至合适大小的匀浆器中。
• 将样品匀浆多次，直至细胞破碎比例达到50%～60%即可停止匀浆。
  
  细胞破碎程度是提取线粒体能否成功的关键，细胞破碎不足会影响线粒体的产量，细胞破碎过度则会影响线粒体结构的完整性。建议提前做预实验探索细胞破碎条件，推荐方案如下：
  

  • 组织样品：匀浆5～10次左右，取匀浆悬液与台盼蓝染液混合，观察细胞破碎情况；
    
  • 细胞样品：需要间隙严密的研杵方能达到破碎效果，匀浆5次后，取匀浆悬液与台盼蓝染液混合，根据破碎情况适当增加匀浆次数。请勿过度匀浆。
  
  
• 在2mL EP管中加入1mL线粒体提取液B，沿管壁缓慢地加匀浆液使其覆盖于上层（此时出现分层现象），立即4℃离心10min（组织样品700×g，细胞样品600×g）。收集1mL最上层分离层至1.5mL EP管中。
  
  离心后上清会分成两层，收集最上层分离层。如果分层不明显则将所有上清收集。
  
  
• 将分离层溶液离心10min（10000×g，4℃），弃尽上清，沉淀即为粗线粒体，用0.5mL线粒体洗涤液重悬。
  
• 在预冷的1.5mL EP管中分别加入425μL线粒体提取液C和75μL线粒体提取液D（即体积比C:D=17:3，现用现配），充分混匀。
  
• 将重悬的粗线粒体缓慢地加入步骤6中混合液的上层，立即离心10min（21000×g，4℃），弃尽上清。
  
  离心机应在15sec以内达到相应转速，否则会影响分离效果。
  
  
• 加入1mL的线粒体洗涤液重悬沉淀，离心5min（16000×g，4℃），收集沉淀，沉淀即为高纯度的线粒体。
  
• 线粒体使用：
  
  • 向沉淀中加入200μL线粒体保存液重悬，吹打混匀后，可用于完整线粒体的功能或酶活性研究。
    
  • 向沉淀中加入100μL线粒体裂解液（可在裂解液中按1:100(V/V)加入蛋白酶抑制剂）重悬，吹打混匀后，即得到线粒体蛋白，可用于SDS-PAGE、WB、IP、Co-IP等后续实验。
• 线粒体染色鉴定：取5μL用线粒体保存液重悬的线粒体，与5μL健那绿染液混匀后，滴加在载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。可观察到线粒体呈现出蓝绿色小棒状或哑铃状。